Determinación del tiempo de lisis del coágulo humano (in vitro) con el plasminógeno/plasmina de cuatro especies: humano, bovino, caprino y porcino / Determining Human Clot Lysis Time (in vitro) with Plasminogen/Plasmin from Four Species (Human, Bovine, Goat, and Swine): humano, bovino, caprino e suíno / Determinação do tempo de lise do coágulo humano (in vitro) com o plasminogênio/plasmina de quatro espécies

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en todo el mundo, entre las cuales las anomalías del sistema del plasminógeno/plasmina son un factor importante en la deficiente lisis de los coágulos sanguíneos. En esta investigación se estudió el sistema fibrinolítico en cuatro especies de mamíferos, entre las que se identificó el plasminógeno humano como el más eficiente en cuanto a su poder trombolítico. Se investigó y se identificó el plasminógeno entre cuatro especies (humano, bovino, caprino y porcino) más eficiente en la lisis del coágulo humano in vitro. Los plasminógenos fueron purificados de forma idéntica por cromatografía de afinidad. El fibrinógeno humano se purificó por fraccionamiento con etanol. Tanto la purificación del plasminógeno como la del fibrinógeno se caracterizaron por electroforesis unidimensional SDS-PAGE al 10 %. La formación del coágulo humano, in vitro, así como su disolución por el plasminógeno/plasmina consistió en la determinación del tiempo de lisis desde la formación del coágulo hasta su dilución. La purificación de las proteínas arrojó una pureza mayor al 95 %; el del plasminógeno humano demostró mayor capacidad de lisis del coágulo que los plasminógenos de los animales. Se determinó que la mayor catálisis y eficiencia corresponden al plasminógeno/plasmina humano, que disuelve el coágulo humano hasta tres veces más rápido que las especies irracionales.

Cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide, including failures in the plasminogen/plasmin system which is an important factor in poor lysis of blood clots. This article studies the fibrinolytic system in four species of mammals, and it identifies human plasminogen with highest thrombolysis efficiency. It examines plasminogen from four species (human, bovine, goat, and swine) and identifies the most efficient one in human clot lysis in vitro. All plasminogens were identically purified by affinity chromatography. Human fibrinogen was purified by fractionation with ethanol. The purification of both plasminogen and fibrinogen was characterized by one-dimensional SDS-PAGE (10%). Human clot formation in vitro and its dissolution by plasminogen/plasmin consisted of determining lysis time from clot formation to its dilution. Purification of proteins showed greater than 95% purity, human plasminogen showed greater ability to lyse clot than animal plasminogen. The article concludes that human plasminogen/plasmin has the greatest catalysis and efficiency, as it dissolves human clot up to three times faster than that of irrational species.

As doenças cardiovasculares são a primeira causa de morte em todo o mundo, entre as quais as anomalias do sistema do plasminogênio/plasmina são um fator importante na deficiente lise dos coágulos sanguíneos. Nesta pesquisa se estudou o sistema fibrinolítico em quatro espécies de mamíferos, entre as que se identificou o plasminogênio humano como o mais eficiente em quanto ao seu poder trombolítico. Realizou-se uma pesquisa e se identificou o plasminogênio entre quatro espécies, (humano, bovino, caprino e suíno) mais eficiente na lise do coágulo humano in vitro. Os plasminogênios foram purificados de forma idêntica por cromatografía de afinidade. O fibrinogênio humano se purificou por fracionamento com etanol. Tanto a purificação do plasminogênio como a do fibrinogênio se caracterizaram por eletroforese unidimensional SDS-PAGE a 10 %. A formação do coágulo humano, in vitro, assim como sua dissolução pelo plasminogênio/plasmina consistiu na determinação do tempo de lise desde a formação do coágulo até a sua diluição. A purificação das proteínas mostrou uma pureza maior a 95 %, o do plasminogênio humano demonstrou maior capacidade de lise do coágulo que os plasminogênios dos animais. Determinou-se que a maior catálise e eficiência correspondem ao plasminogênio/plasmina humana, que dissolve o coágulo humano até três vezes mais rápido do que as espécies irracionais.

Diferencias cinéticas de las plasminas de ocho especies mamíferas: activaciones y secuencias de los terminales-N / Kinetic Differences of Plasmins from Eight Mammalian Species: N-Terminal Activations and Sequences / Diferenças cinéticas das plasminas de oito espécies mamíferas: ativações e sequencias dos terminais-N

El artículo determina los parámetros cinéticos de las plasminas de ocho especies de mamíferos y sus terminales-N. Los ocho plasminógenos fueron purificados por los mismos métodos (cromatografías de afinidad e intercambio iónico), y activados con urocinasa, partiendo de una concentración común y su cinética valorada según las coordenadas de Lineweaver-Burk. Para esto se utilizó la cinética enzimática de Michaelis Menten, ampliamente usada en el estudio de enzimas. Todos los plasminógenos mostraron una pureza superior al 95% y una banda de 92 kDa en la electroforesis, al comparar con el estándar de peso molecular utilizado. Las plasminas del equino y canino mostraron la misma K M por el sustrato cromogénico (0,438 mM), siendo esta la de mayor afinidad en este estudio y la humana la de menor afinidad (5,3 mM). También fueron determinadas la constante catalítica y la velocidad de conversión del sustrato cromogénico a producto. Los terminales-N de los plasminógenos de las ocho especies fueron determinados, y se encontraron diferencias entre el humano y los animales; así mismo entre algunos animales. Solo el porcino y el ovino no mostraron diferencia alguna en su terminal-N (DPPDDY). Se demostró la unificación del método de purificación de los plasminógenos para cualquier especie, las diferencias cinéticas de las ocho plasminas estudiadas, y las similitudes y diferencias en la secuencia de los terminales-N de las ocho especies.

The paper determines the kinetic parameters of plasmins from eight species of mammals and their N-terminals. They were purified by the same methods (affinity chromatography and ion exchange) and activated with urokinase, starting from a common concentration and its kinetics judged according to Lineweaver-Burk coordinates. For such purpose, MichaelisMenten enzyme kinetics, which is widely used in the study of enzymes, was implemented. When compared with the molecular weight standard used, all plasminogen showed a purity exceeding 95% and a 92 kDa band on electrophoresis. Equine and canine plasmins showed the same K M due to the chromogenic substrate (0.438 mM), this being the one with the highest affinity in this study, and the human being the one with the lower affinity (5.3 mM). The catalytic constant and the conversion rate of the chromogenic substrate to product were also determined. The N-terminals of the plasminogens of the eight species were determined, and differences were found between humans and animals, as well as between some animals. Only pigs and sheep showed no differences in their N-terminal (DPPDDY). The unification of the method for purification of plasminogens for any species was demonstrated, as well as the kinetic differences of the eight plasmins studied and the similarities and differences in the sequence the N-terminals of the eight species.

El artigo determina os parâmetros cinéticos das plasminas de oito espécies de mamíferos e seus terminais-N. Estes foram purificados pelos mesmos métodos (cromatografias de afinidade e intercambio iônico) e ativados com uroquinase, partindo de uma concentração comum e sua cinética avaliada segundo as coordenadas de Lineweaver-Burk. Para isto se utilizou a cinética enzimática de Michaelis-Menten, amplamente usada no estudo de enzimas. Todos os plasminogênios mostraram uma pureza superior a 95 % e uma banda de 92 kDa na eletroforese, ao comparar com o padrão de peso molecular utilizado. As plasminas do equino e canino mostraram a mesma KM pelo substrato cromogênico (0,438 mM), sendo esta a de maior afinidade neste estudo e a humana a de menor afinidade (5,3 mM). Também foram determinadas a constante catalítica e a velocidade de conversão do substrato cromogênico a produto. Os terminais-N dos plasminogênios das oito espécies foram determinados, e se encontraram diferenças entre o humano e os animais, da mesma forma entre alguns animais. Somente o suíno e o ovino não mostraram diferença alguma em seu terminal-N (DPPDDY). Demonstrou-se a unificação do método de purificação de os plasminogênios para qualquer espécie, as diferenças cinéticas das oito plasminas estudadas e as similitudes e diferencias na sequencia dos terminais-N das oito espécies.

Purificación y activación de los plasminógenos caprino y canino: comparación con el plasminógeno humano / Purification and activation of caprine and canine plasminogens: Comparison with human plasminogen

Objective: To unify the purification and activation of plasminogens from three different species, namely: human, caprine and canine. Materials and methods: Lysine-Sepharose 4B and sephacel DEAE were used, for affinity and ion-exchange chromatography, respectively. The N-terminal sequence was determined for both the intact and degraded plasminogens. Results:Bands of 92 kDa corresponding to native plasminogens were identified in the three species. Their N-terminal sequences were found to be EPLDDY, DPLDDY and XXLDDY for human, caprine and canine plasminogen, respectively. Furthermore, the degraded in vivo circulating plasminogens from the three species were purified and their N-terminal sequences were KVYLSE, RITLL and RIYLS for the human, caprine and canine, in that order. Conclusion: Activation of the three plasminogens confirmed the formation of the typical electrophoretic bands for human plasmin corresponding to the heavy A and the light B chains which were also identified in the caprine and canine plasmins. This new purification methodology facilitates the comparison and further elucidation of the fibrinolytic systems in mammals.

Objetivo: unificar la purificación y activación de los plasminógenos de tres especies diferentes, a saber: humana, caprina y canina. Materiales y métodos: se usaron Lysina-Sefarosa 4B y Sefacel DEAE para las cromatografías de afinidad y de intercambio iónico, respectivamente. Se determinó la secuencia terminal-N tanto de los plasminógenos intactos como de los degradados. Resultados: en las tres especies se identificaron bandas de 92 kDa correspondientes a los plasminógenos nativos. Se halló que sus secuencias terminales-N eran EPLDDY, DPLDDY y XXLDDY para los plasminógenos humano, caprino y canino, respectivamente. Además, se purificaron los plasminógenos degradados circulantes, cuyas secuencias terminales-N fueron, en el mismo orden, KVYLSE, RITLL Y RIYSL. Conclusión: la activación de los tres plasminógenos confirmó la formación de las bandas electroforéticas típicas de la plasmina humana correspondientes a las cadenas pesada A y liviana B, que también se identificaron en las plasminas caprina y canina. Este nuevo método de purificación facilita la comparación y el esclarecimiento de los sistemas fibrinolíticos de los mamíferos.

Comparación de la activación y la cinética de laplasmina bufalina con la humana / Ativação e cinética comparativa da plasmina bufalina e a humana / Comparative activation and kinetic of plasmin bufaline with the human one

El plasminógeno es el zimógeno de la plasmina, enzima activada a nivel fisiológico por el activadortisular del plasminógeno y la urokinasa, la plasmina es la enzima encargada de disolver el coágulosanguíneo. En este estudio se compararon la plasmina humana con la bufalina en su forma de activación dezimógeno a enzima y en la afinidad hacia el sustrato cromogénico. Los plasminógenos fueron purificadospor el mismo método de cromatografías de afinidad y cambio iónico. De igual manera las activaciones sehicieron utilizando urokinasa humana en ambos casos. La plasmina bufalina demostró mayor activacióny afinidad (1.35mM) que la plasmina humana (2.16 mM), siendo la bufalina 1.5 veces mas afin al sustratocromogénico que la humana. Este estudio demuestra que el método de purificación de los plasminógenospuede ser el mismo para muchas especies, se demuestra una vez más que las plasminas animales al parecerson más eficientes en la disolución del coágulo o degradación de sustratos, que la plasmina humana.Este estudio indica que la plasmina bufalina puede ser utilizada en los parámetros que se determinanclínicamente en pacientes con problemas cardiovasculares, reduciendo el tiempo de determinación de estosparámetros fibrinolíticos, que pueden dar al médico un margen de tiempo superior para actuar.

The Plasminogen is the zymogene of the Plasmin, enzyme which physiologically is activated by twodifferent enzymes, the tissue plasminogen activator and the urokinase, the plasmin is the enzyme that dissolves blood clots. In this study the human plasmin was compared to the bufaline plasmin, in theactivation from the zymogene to the enzyme form as well as in the affinity to the chromogenic substrate.The two plasminogens were purified by the same chromatographies methods: affinity and ion-exchange.Furthermore, both plasminogens were activated by human urokinase. The bufaline plasmin showed moreactivation and affinity (1.35 mM) that the human plasmin (2.16 mM), in addition, the bufaline plasmindemonstrated a 1.5 times more affinity to the chromogenic substrate that the human plasmin. This studydemonstrated that the plasminogens of several species can be purified by this method. Besides, one moretime the animal’s plasmins probably to be more efficient in the dissolution of blood clots or degradation ofsubstrates than the human plasmin. More over this study indicated that the bufaline plasmin can be usedin clinical determinations of patients with cardiovascular diseases. This also reduces the determinationtime of fibrinolytic parameters that physicians can give, having more time to take appropriate treatment.

O plasminogênio é o zymogen da plasmina, enzima ativada a nivel fisiológico pelo ativador tissulardo plasminogênio e uroquinase, plasmina é a enzima responsável de dissolver o coágulo de sanguíneo.neste estudo foi comparada a plasmina humana com a plasmina búbalina em seu modo de ativaçãode zymogen a enzima e na afinidade substrato cromogênico. Os plasminogênio foram purificados como mesmo método de cromatografia de afinidade e de troca iônica, e as ativações foram feitas usandouroquinase humana nos dois casos. A Búfalo plasmina mostrou maior ativação e afinidade (1.35 mM)que a plasmina humana (2.16 mM), sendo a bufalina 1.5 vezes mais afim ao substrato Cromogênico quea humana. Este estudo mostrou que o método de purificação do plasminogênios pode ser o mesmo paramuitas espécies, alem disso, que as plasminas animais são mais eficientes na dissolução do coáguloo degradação de substratos que a plasmina humana. Este estudo indicou que a plasmina búfalo podeser utilizada nos parâmetros determinados clínicamente em pacientes com problemas cardiovasculares,diminuindo o tempo de determinação destes parâmetros fibrinolíticos, que podem dar ao médico umintervalo de maior tempo para atuar.